DNA甲基化是生物体内一种重要的表观遗传修饰过程,它由DNA甲基转移酶(DNAmethyl-transferase, Dnmts)催化,利用S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体,将胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶(mC)。这种修饰方式通常会抑制基因表达,而去甲基化则会促使基因的重新活化,进而影响基因表达而不改变基因序列。通过对基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理,未甲基化的胞嘧啶会被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则保持不变。
在接下来的分析中,我们可以设计特异性引物,针对甲基化和非甲基化的DNA序列进行PCR扩增。随后,通过电泳对MSP扩增产物进行检测。如果使用针对处理后甲基化DNA链的引物能够获得扩增片段,则表明该位点存在甲基化;如果反之,则说明该位点不存在甲基化。
另外,通过亚硫酸氢盐处理后的基因组DNA,未发生甲基化的胞嘧啶将被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变。接下来,设计BSP引物进行PCR扩增,在扩增的过程中,尿嘧啶会全部转化为胸腺嘧啶。最终,再将PCR产物克隆至载体后进行测序,就能够判断CpG位点是否发生了甲基化,这种方法称为BSP-克隆测序法。
在样本收集方面,动物组织的要求是新鲜组织量达到100mg(相当于黄豆大小),最少50mg(相当于绿豆大小),在收集后需使用干冰运输;细胞样本则需收集1×106个细胞沉淀,同样使用干冰运输;全血样本要求最少1mL的新鲜血液,使用EDTA抗凝管存储,在-20度下运输。
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